我國(guó)生物制品中殘余DNA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)

我國(guó)參照WHO、FDA和歐盟的標(biāo)準(zhǔn)，很早以前開始就對(duì)生物制品中殘余DNA的含量進(jìn)行限制。酵母、大腸桿菌表達(dá)的生物制品限定不超過10ng/劑，CHO和vero細(xì)胞表達(dá)的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過100或10pg/劑。2010年版中國(guó)藥典附錄收錄了DNA 探針雜交法和熒光染料法作為殘余DNA檢測(cè)方法。以地高辛標(biāo)記斑點(diǎn)雜交法為代表的DNA雜交法因?yàn)椴僮鲝?fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，且只能半定量，在2014年美國(guó)藥典修訂版征詢意見稿中（ PF40(2)）中已經(jīng)被剔除。以PicoGreen為代表的熒光染料法是基于熒光染料分子直接與雙鏈DNA結(jié)合后,經(jīng)帶有熒光檢測(cè)功能的酶標(biāo)儀激發(fā)后產(chǎn)生熒光信號(hào)，因?yàn)椴荒軝z出單鏈DNA，且沒有序列特異性，以及靈敏度較低（>300pg）等原因，早已被歐美藥典摒棄。

我國(guó)2010版藥典及2015版藥典（附錄IX B 外源性 DNA 殘留量測(cè)定法）的征求意見稿中收載了的DNA探針雜交法和熒光染料法，而2009年美國(guó)USP就收錄了雜交法、閾值法和qPCR法，到2015年底USP只收錄高靈敏度、高特異性的qPCR法作為殘留DNA檢測(cè)的推薦方法。由此可見qPCR法將成為國(guó)際公認(rèn)的殘留DNA檢測(cè)方法，也可能會(huì)是我國(guó)下一版藥典的主要修訂內(nèi)容。國(guó)內(nèi)生物制品研發(fā)與生產(chǎn)企業(yè)，以及生產(chǎn)純化填料的上下游企業(yè)，盡早建立以qPCR方法為基礎(chǔ)的宿主殘余DNA檢測(cè)體系，將有利于改進(jìn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家生物藥品標(biāo)準(zhǔn)的接軌。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)庫中的試劑盒技術(shù)性能

為了提升國(guó)內(nèi)企業(yè)和監(jiān)管部門對(duì)生物制品中宿主殘余DNA的檢測(cè)技術(shù)水平，實(shí)現(xiàn)與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的接軌，中檢院聯(lián)合中科院、生產(chǎn)與研發(fā)企業(yè)開發(fā)了首個(gè)基于qPCR技術(shù)，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)CHO宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒。研發(fā)中除了常規(guī)方法學(xué)研究和穩(wěn)定性考察，還開展了DNA碎片化、種屬特異性、不同的儀器通用性、抗蛋白干擾、國(guó)外同類產(chǎn)品性能對(duì)比等研究，并在驗(yàn)證試驗(yàn)中考察了對(duì)國(guó)內(nèi)多家生產(chǎn)企業(yè)和研發(fā)企業(yè)不同樣本基質(zhì)的適用性。由中檢院采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CHO細(xì)胞DNA標(biāo)定并驗(yàn)證的試劑盒提供了從樣品提取、純化到PCR檢測(cè)的整套試劑，定量靈敏度達(dá)到10fg/rxn，DNA片段大于120bp，內(nèi)標(biāo)加樣回收率在70~130%（新版美國(guó)USP的標(biāo)準(zhǔn)將調(diào)整為50~150%），可以為CHO細(xì)胞表達(dá)的不同品種、不同劑量的生物制劑提供靈活、準(zhǔn)確的DNA限量檢測(cè)。試劑盒具有2年保質(zhì)期，并由聯(lián)合研發(fā)單位中科院湖州營(yíng)養(yǎng)中心提供免費(fèi)技術(shù)咨詢和操作培訓(xùn)服務(wù)，幫助企業(yè)盡快掌握該技術(shù)。中檢院和中科院湖州營(yíng)養(yǎng)中心的聯(lián)合研發(fā)項(xiàng)目還將陸續(xù)推出E.coli、Yeast和vero細(xì)胞殘余DNA檢測(cè)試劑盒，為國(guó)內(nèi)生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、為監(jiān)管部門制訂國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

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