生產的二級生物安全柜是目前應用最為廣泛的柜型。與Ⅰ級生物安全柜一樣，Ⅱ級生物安全柜也有氣流流入前窗開口，被稱作“進氣流”，用來防止在微生物操作時可能生成的氣溶膠從前窗逃逸。與Ⅰ級生物安全柜不同的是，未經過濾的進氣流會在到達工作區域前被進風格柵俘獲，因此試驗品不會受到外界空氣的污染。 Ⅱ級生物安全柜的一個獨特之處在于經過HEPA過濾器過濾的垂直層流氣流從安全柜頂部吹下，被稱作“下沉氣流”。下沉氣流不斷吹過安全柜工作區域，以保護柜中的試驗品不被外界塵埃或細菌污染.